中国领先的工业平台

返回贤集网 返回论坛

冰雪无疆

+关注

植物体内源性一氧化氮的检测方法的概述

        NO即是水溶性又是脂溶性的气体自由基小分子,它具有一个未成对的电子对。这些特性使得能够在细胞中自由移动,顺利穿过膜系统,并且能够被细胞内其他成分有效清除。在细胞内能够快速运动且能被迅速清除,这些特性使其成为理想的信号分子,不仅能够作为分子开关精确调控一系列细胞内的生命活动,而且能够同细胞内其他信号分子一起相互作用,激活放大细胞内的信号瀑布。

       N O 在植物体内有如此多的作用, 因而如何快速、灵敏和直接地对其进行检测显得非常重要。但N O 的半衰期短, 仅为3 -5 s , 极易被氧化,在植物体内含量极低, 因此给检测带来诸多困难。迄今直接检测植物体中N O的方法并不多, 一些比较成熟的检测动物体内N O 的方法还难以直接应用于植物组织内N O的检测, 为了促进植物体内NO检测方法研究的深入研究,总结一下近年来检测关于在植物体内N O 的方法的进展。

1、化学发光法

N O能被臭氧(0 3 )氧化成激发态 N02*,N02*在返回基态时发射波长为60 0-3 000nm 的光,因此通过发射光的检测可以实现NO的定量测定。此方法具有较高的灵敏度,目前在检测植物内N O时仍会常采用。有研究报道将叶片总面积约达500~1000cm2的整株向日葵或菠菜转移到实验装置中 , 植物上部放在连续搅拌的釜式反应器内 , 其生成的NO气体进入反应室中与 0 3 作用 , 检测发光强度就可测定出 N O 量。尽管臭氧化学发光法有较高的灵敏度 , 但此法只能检测气相中N O, 对于溶液中的 N O 必须用惰性气体将其抽提出来, 但这易受样品中其他因素的干扰,因此其所测定的N O 含量并不能完全代表组织细胞内的实际含量。

2、分光光度法

NO易被氧化生成NO2-, 在酸性条件下溶液中的NO2-可与 G i r e s s 试剂发生重氮化反应 , 生成橙红色产物, 此产物在波长 550 nm 处有最大吸收峰 , 吸光度与NO2-或 NO的含量成正比 , 以此可以测定 N O 的量。但由于此法测定的NO是一种间接测定 NO 的方法 , 其选择性较差。此外 , 还可以根据 N O 与氧合血红蛋白( H bO Z)反应生成高铁血红蛋白(m e tHb ) 后 , 其最大吸收波长会发生改变的原理检测波长401nm 和421m处吸光度的变化以确定 NO含量变化,此法已可于检测植物体释放 N O的研究。但是此种方法使用的血红蛋白除与 N O 作用外 , 还能与活性氧等发生反应 , 因此用此法难以准确检测 N O 的实际含量。

3、电化学法

电化学法是直接测定 N O 的一种常用方法,主要包括还原法、氧化法及催化氧化法。是根据 NO易失去电子被氧化后在正极发生电化学反应的原理 , 通过测试反应产生的氧化电流大小检测 N O的浓度。此法能够实现溶液中NO的实时在线检测,而且灵敏度高。该类型的传感器可检测属于常春藤叶型的蔓性天竺葵叶片中产生的NO , 可实现对目标植物组织或细胞产生的内源性的NO的在线原位检测,这也说明电化学法具有较好的应用前景。此外人们通过电极的基础实验研究迄今己开发出几种商品化的NO微传感器 , 其中丹麦 unisense公司开发的一系列微电极传感器应用较多 , 因其微电极的尖端细(微米级),相应速度快(小于1s),并可通过实现对植物组织内的一氧化氮的原位测试,因为在以电化学法检测植物体内N O时多采用此类传感器。 

4、电子顺磁共振波谱法

电子顺磁共振 ( E P R ) 又称电子自旋共振(E SR ), 常用来检测和研究含有未成对电子的顺磁性物质。 N O 分子含有一个未成对电子 , 因此用 ES R 波谱测定比较适合。 由于 N O 的寿命短 , 需采用自旋捕获剂将其捕获形成稳定的自由基或配合物 , 常采用的自旋捕获剂有血红蛋白( H b ) 、有机化合物和亚铁配合物等。 N O 被捕获后生成顺磁性物质 , 在磁场作用下 , 未成对电子能级发生分裂 , 当外加的电磁波能量与电子分裂的能级差相等时 , 未成对电子即会发生跃迁 , 电子顺磁共振仪上即显示 出信号 , 其信号强度与 N O 含量成正 比 , 据此可测定 N O 量。E S R 波谱法还曾用于检测拟南芥N O 释放量的结果表明 , 受丁香假单胞菌感染后的拟南芥能够产生 N O 以防止细菌扩散,但此法存在线性范围窄和设昂贵等缺点。

5、荧光法

D NA 与 NO在酸性条件下能反应生成荧光物质 l- H-萘三唑 , 此物质在 p H> l 0、激发波长为36 5 n m、发射波长为450nm 条件下具有很强的荧光效率 , 可用此物质间接测定 N O 含量。尽管荧光法能够测定细胞内 N O 的产生和空

间分布 , 并有一定的灵敏度 , 但此法仍有一些不足 , 如有些探针不能与 N O 直接作用 , 而是与 N O 的氧化产物反应 , 因此荧光强度不仅与 N O 产生量有关 , 还与N O 的氧化产率和浓度有关 , 且在缺氧条件下是不适用的。

6、其他方法

近年来质谱法和光声光谱法也常用于 N O 的检测,其中质谱法将质谱仪膜进样口和限制性毛细管进样口相结合建立了一种快速 、 特效 、 非侵入式的测定 各种器官组织内或 整个植物释放 N O 的方法 。 此法能够区分氮同位素,而且能从同一样品中同时测出 N O 、 02以及其他气体。光声光谱法也是一种非侵入式检测 N O 的方法 , 此法是以光声效应为基础的一种吸收光谱分析技术。光声信号强度与样品的浓度成正比 , 据此可进行样品的定量分析。

    

最新评论

0个回复,共0