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重组蛋白表达的步骤是怎样?重组蛋白表达系统是什么?做蛋白表达服务的公司哪家比较专业?

小弟最近在整理重组蛋白方面的知识点,对有些基础知识还是区分不太清楚!比如重组蛋白表达的步骤是怎样?重组蛋白表达系统是什么?做蛋白表达服务的公司哪家比较专业等问题,求解~

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不同的系统步骤稍微有些不同的,大致步骤如下:真核表达系统的重组蛋白表达步骤:a.      选择表达载体和宿主细胞(常用的CHO和HEK293)b.      表达载体的构建c.      无内毒素的质粒抽提d.      细胞瞬时转染e.      表达小试,条件优化f.       表达分析和鉴定(SDS-PGAE和WB)g.      大量表达h.      亲和纯化i.        检测和鉴定原核表达系统的重组蛋白表达步骤:a.      选择表达载体b.      密码子优化c.      基因合成/亚克隆d.      转化表达菌株e.      蛋白表达小试分析f.       如果蛋白可溶,蛋白亲和纯化g.      如果蛋白不可溶,则需要变复性来制备可溶蛋白。h.      鉴定,包括SDS-PAGE和WB鉴定
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楼上兄弟只回答了一点啊,补充一下吧~重组蛋白表达系统主要分原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统、转基因植物表达系统和转基因动物表达系统六大重组蛋白表达系统。至于做表达系统服务的公司嘛,如果是原核表达系统的,如大肠杆菌,那有很多的,可以搜一下,如果是真核的就稍微少点,毕竟门槛高很多,像金斯瑞和纽普生物都还不错,常见女的表达系统都能做,而且交付好。
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  • 工人啊! 这六大系统他们都能做?
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蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。在基因工程技术中占有核心地位。 编辑本段蛋白表达系统概述   蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成:   1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同,适合表达蛋白的种类也不相同。   2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同,分为原核(细菌)表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导,外源基因可以在宿主中表达。   3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。 编辑本段蛋白表达系统分类及优劣分析   原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统,也是最经济实惠的蛋白表达系统。原核蛋白表达系统以大肠杆菌表达系统为代表,具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点,缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制,如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠,得到具有生物活性的蛋白的几率较小。   酵母蛋白表达系统以甲醇毕赤酵母为代表,具有表达量高,可诱导,糖基化机制接近高等真核生物,分泌蛋白易纯化,易实现高密发酵等优点。缺点为部分蛋白产物易降解,表达量不可控。   哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式,最容易保留生物活性,缺点是表达量通常较低,稳定细胞系建立技术难度大,生产成本高。 编辑本段大肠杆菌表达系统   在各种表达系统中,最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统,也是目前掌握最为成熟的表达系统,大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统。   对于表达不同的蛋白,需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游,以外源基因mRNA的AUG为起始翻译,表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。   大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等。 编辑本段酵母表达系统   酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统,由于兼具原核以及真核表达系统的优点,正在基因工程领域中得到日益广泛的应用,应用此系统可高水平表达蛋白,且具有翻译后修饰功能,故被认可为一种表达大规模蛋白的强有力的工具。   常用的酵母表达系统:   一,酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统:   酿酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在酿酒业和面包业的使用已有数千年的历史,被认为是GRAS(generally recognized as safe)生物,不产生毒素,已被美国FDA确认为安全性生物,但酿酒酵母难于高密度培养,分泌效率低,几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质,也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化,而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此,一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌   二,甲醇营养型酵母表达系统:   甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有汉森酵母属(Hansenula),毕赤酵母属(Pichia),球拟酵母属(Torulopsis)等,并以毕赤酵母属(Pichia)应用最多。   甲醇酵母的表达载体为整合型质粒,载体中含有与酵母染色体中同源的序列,因而比较容易整合入酵母染色体中,大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1),在该基因的启动子(PAOX1)作用下,外源基因得以表达。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞,不会发生超糖基化。   酵母表达的特点酵母是一种单细胞低等真核生物,培养条件普通,生长繁殖速度迅速,能够耐受较高的流体静压,用于表达基因工程产品时,可以大规模生产,有效降低了生产成本。 编辑本段昆虫表达系统   昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统,它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能,如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等,使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白;其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%;可表达非常大的外源性基因(一200kD);具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力;对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高,至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。。常用的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕型多角体病毒(BmNPV),常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞,用于表达外源基因的质粒来源于PUC系列,其含有一个多克隆位点和多角体蛋白启动子。[1]   杆状病毒系统的主要有点包括   1,组蛋白具有完整的生物学功能,如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配   2,蛋白翻译后的加工修饰;   3,表达水平高,可达总蛋白量的50%;   4,可容纳大分子的插入片段;   5,能同时表达多个基因。主要缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下,这时由于病毒感染,细胞开始死亡。 编辑本段哺乳动物表达系统   哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间,而利用病毒表达系统则可快速感染细胞,在几天内使外源基因整合到病毒载体中,尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。   根据目的蛋白表达的时空差异,可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养,载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失,目的蛋白的表达时限短暂;瞬时表达系统的优点是简捷,实验周期短。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养,载体DNA稳定存在于细胞内,目的蛋白的表达持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤,稳定表达相对耗时耗力。诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以开放。采用异源启动子、增强子和可扩增的遗传标记,可提高蛋白产量。   哺乳动物表达系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势,适合表达完整的大分子蛋白。由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质,在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统,更接近于天然蛋白质,但构成复杂、操作技术要求高、表达产量不大、产率低,且有时会导致病毒感染等是该表达系统的不足之处。 编辑本段植物表达系统   植物能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质易于大规模培养和生产,且在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势,因此利用植物生产外源蛋白质的研究展现了极其诱人的前景。多种抗体、酶、激紊、血浆蛋白和疫苗等都已通过基因工程的手段在植物的叶、茎、根、果实、种子以及植物细胞和器官中得到表达,然而提取与纯化始终是大规模利用植物生产重组蛋白的主要障碍。Doloressa等据内质网和内质网信号肚在蛋白质合成中的作用,把3种重组蛋白,即嗜热细菌来源的木聚糖酶、水母的绿色荧光蛋白和人胎盘分泌的碱性磷酸酶(SEAP)定位到质外体中,通过根分泌和叶分泌途径获得表达,从而建立了两种新的重组蛋白表达系统——植物根分泌和叶分泌,简化了分离和纯化程序,为利用转基因植物大规模生产重组蛋白提供了潜在的途径。虽然利用植物表达、生产外源性蛋白起步较晚,但目前已经能够利用植物生产多种医用、食用以及工业用蛋白及酶制剂。   总之,各种表达系统各有优缺点,使用大肠杆菌表达系统能够在较短时间内获得表达产物,且所需的成本相对较低;但目的蛋白常以包涵体形式表达,产物纯化困难,且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低。酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高,成本低,但翻译后加工修饰体系与哺乳动物不完全相同。哺乳动物表达系统产生的蛋白质更接近于天然状态,但表达量低,操作繁琐。因此,选择表达系统时,应充分考虑各种因素,如要表达蛋白的性质、生产成本、表达水平、安全性、表达周期等。随着对外源基因表达系统研究的不断深入,随着更多表达机理和影响因素的发现,相信在不久的将来,原核与真核两种表达系统在重组蛋白的生产研究中仍然都会占有一席之地,并将出现更多更加完善的表达系统。
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  • 工人啊! 谢谢老师分享的知识
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蛋白表达纯化已经是非常经典简单的实验了。 1 首先要知道你要纯化蛋白的编码DNA序列,查阅相关文献,看目的基因在那些细胞或者组织中高表达,进而设计该基因的引物,扩增出目的DNA片段的ARF。这一布叫目的基因片段的获取 2 构建表达载体:根据你获得的基因本身的特性确定原核或者真核载体中表达,这一步的主要问题就是构建带有目的基因的质粒,导入表达系统中。一般原核表达时间短,成本低,表达量大,常优先考虑;但是有些基因在E coli中就是表达不出,可能是密码子优化等出现问题,也或者是由于想纯化得到更好的活性蛋白的考虑(原核的蛋白折叠系统显然没有真核的好),有很多研究者选择在毕赤酵母中表达。(我手里就有相关资料,因为以前做过表达纯化及后来的单抗制备),这一步再强调一下,优化密码子对于蛋白的成功表达很重要 3 载体构建好了,下面就是重组蛋白的表达了。这一过程涉及到用多少的诱导剂,诱导多少时间才能得到最多的蛋白的问题,即优化表达条件。就是在上述不同量诱导剂诱导条件下,取菌体上清(分泌型)或者破碎细胞(胞内表达的蛋白)电泳,看是否得到目的分子量大小的蛋白 4 蛋白表达成功,下面是根据蛋白质本身亲水/疏水,电荷带电特性等确定蛋白纯化的方法。一般步骤:离心,取蛋白所在的相 如果是分泌表达的蛋白,则取上清,超滤,没有超滤仪器可以用透析袋等代替,用离子交换柱层析。基本上这一步能得到纯化的95%的蛋白,电泳鉴定基本不会看到有杂带出现。如果还是纯度不符合要求,可以在表达蛋白最初在构建表达载体质粒的时候在蛋白的ORF后面加上HIS-标签,这样得到的蛋白不但可以用于HIS柱的进一步纯化,在不确定自己的融合蛋白是否有表达的时候,也可以单单用抗HIS的抗体做一WB,分析确认目的蛋白是否表达,这是蛋白表达的常用手段。 5 经过纯化后的蛋白仍然含有一部分无机盐,如果需要的话可以将蛋白经真空冻干机冻干,得到纯蛋白。
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  • 工人啊! 是的,但就是做的不稳定
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  • 桑建伟 要重复试验
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我滴天,三个问题,一问三不知~
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我们把一段能表达外源蛋白的DNA插入到载体上原有结构基因的内部,为了使ORF正确,,我们应该怎么办?从联合载体上考虑
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