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革兰氏阴性菌别猖狂 改造抗生素有了新策略

在人类与致病菌的抗争中,抗生素是人类的重要武器,但道高一尺魔高一丈,随着细菌抗性的出现,抗生素也面临着失灵的窘境,特别是革兰氏阴性菌(例如大肠杆菌、铜绿假单胞菌)这种难对付的病菌。革兰氏阴性菌有两层细胞膜,最外层覆盖的脂多糖对大多数小分子来说都难以跨越。另外,就算小分子进入细胞内部,也会被细菌的外排泵(efflux pump)感知并排出细胞外。在美国最近一次对革兰氏阴性菌有用的新药获批上市,还要追溯到 1968 年的喹诺酮类抗生素,几乎半个世纪过去了,各大小药厂一无所获。并不是人类不努力,而是革兰氏阴性菌太狡猾,2007 年制药巨头 GSK 筛选了 50 万种化合物,最终也没有找到一种能对抗大肠杆菌的新药。


如何在革兰氏阴性菌中使得药物的进入速度大于被排出的速度,使得药物能累积到有效浓度,来自美国伊利诺伊大学的 Paul J. Hergenrother 等人给出了新的策略。他们研究了超过 180 种能进入并在大肠杆菌中累积的不同药物,发现胺类、两亲性且刚性、结构球形度低的分子更容易留在大肠杆菌中。用这种策略他们对一种原本只作用于革兰氏阳性菌的天然产物——脱氧尼博霉素(Deoxynybomycin,DNM)进行了改造,得到的新化合物活性大变,可以抑制多药耐药的革兰氏阴性病菌。这一激动人心的成果发表在了 Nature 上。


Paul Hergenrother 教授(前排)研究团队


大部分抗生素都是天然产物或其衍生物,考虑到结构复杂性和多样性,作者选取了 100 个代表性的化合物,从分子结构、分子量、ClogD7.4 和电荷进行分析它们在大肠杆菌 E. coli MG1655 中的累积能力,虽有研究发现化合物的累积程度和 ClogD7.4 相关,但从图 1 可以看出,结论与之大相径庭。在这 100 个化合物中,电荷是首要因素,带正电荷的化合物最易累积(12/41)。相比之下中性化合物(0/39)和带负电荷化合物(0/20)没有一个能在大肠杆菌中累积,即使是羧酸(ClogD7.4 < -5)也没有累积。这 12 个化合物都是胺类化合物,其中 8 个是伯胺。将氨基转变为羧酸、酰胺、酯、氰基、叠氮、醇,都削弱了累积能力,甚至连胺上有取代基都不行。


图 1. 不同电荷化合物在 E.Coli 中的累积能力


作者随后的研究对象是 68 种不同结构的伯胺化合物。虽有 36 个伯胺化合物具有累积能力,但也没有充分的理由认为伯胺就是关键因素,毕竟还有 32 个伯胺化合物没有表现出在大肠杆菌中累积。将这些化合物的化学信息进一步归类分析,作者发现分子的柔性(用可旋转的化学键来表征)和形状(用球形度来表征)是能否累积的关键因素。球形度是个相对的参数,如纯平面的苯球形度为 0,而球形的金刚烷球形度为 1。如图 2 所示,化合物具有相似的官能团时比较累积能力,刚性结构(化合物 16 只有 4 个可旋转键)大于柔性结构(化合物 17 有 13 个可旋转键),而低球形度化合物(化合物 18 为 0.14)大于高球形度化合物(化合物 19 为 0.49)。最终作者得出结论,刚性(不多于 5 个可旋转键)且球形度不高于 0.25 的伯胺化合物,具有更高的在大肠杆菌中累积的可能性。


图 2. 相似官能团化合物的累积能力


根据这个原则,作者将目光瞄向了脱氧尼博霉素 DNM,它是一种强效抑制革兰氏阳性菌的天然产物分子,对革兰氏阴性菌没有活性。DNM 的结构同时兼有两个关键参数:刚性和较低的球形度,它没有可旋转的化学键,球形度仅为 0.02。作者设想如果在合适的部位引入氨基,就有可能将其改造为对付革兰氏阴性菌的大杀器。首先试验的是伯胺衍生物和扩环衍生物,将原来的 5 元环扩展为 6 元环,得到 6DNM。没有伯胺基团的 6DNM 对革兰氏阳性的金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的活性为 MIC = 0.06–1 μg/ml,但它对大肠杆菌没有活性(MIC > 32 μg/ml),累积能力很弱。引入氨基后的 6DNM-NH3 不仅保持着对金黄色酿脓葡萄球菌的活性(MIC = 0.03-0.5 μg/ml),还获得了对大肠杆菌 E. coli MG1655 的活性(MIC = 0.5 μg/ml),累积能力也大大提高。如果氨基被乙酰化或者被羧酸基团替代,抗大肠杆菌活性以及累积能力也随之消失。


图 3. 6DNM 和 6DNM-NH3 的结构和活性


进一步的实验表明,6DNM-NH3 并且对常见的革兰氏阴性病菌都表现出了很好的抑制活性,ESKAPE(E. coli, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa)中也仅仅对 P. aeruginosa 无效。更惊人的还在后面,对于一株多药耐药的大肠杆菌(ATCC BAA-2469),第三代喹诺酮类抗生素环丙沙星(ciprofloxacin)无可奈何(MIC > 64 μg/ml),而 6DNM-NH3 可以轻易杀灭(MIC = 4 μg/ml)。

作者还研究了 6DNM-NH3 在大肠杆菌中累积的原因,6DNM-NH3 的伯胺基团与细菌膜上孔蛋白(porin)的一个关键天冬氨酸残基的相互作用是其中的关键。


图 4. 伯胺基团存在(a/b)与不存在(c/d)的差别,图中紫色为孔蛋白关键天冬氨酸残基 Asp113


能抑制革兰氏阴性菌的抗生素一直是科学家苦苦探索的目标,Hergenrother 教授团队的这项研究为设计或改造抗生素提供了新的策略,化合物的电荷、刚性和分子形状都会影响其在革兰氏阴性菌中的累积及生物活性。运用这一策略,不仅能够将只对革兰氏阳性菌有活性的化合物修饰为广谱抗生素,如 6DNM-NH3,同时,还能指导新化合物的设计。这一成果对于人类对抗革兰氏阴性菌有着重要的意义。

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